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    丁酸梭菌C-101益生性及抗逆性研究

    文章來源:好實沃生物 作者:湯立 更新時間:2022-11-11

      丁酸梭菌(Clostridium butyricum)屬于厭氧革蘭氏陽性菌,電子顯微鏡下觀察其菌體形態呈直或略有彎曲的桿狀,單個或成對,部分呈絲狀,短鏈,白色略帶灰感,細菌直 徑為(0.6~1.4)×(2.7~7.3)μm,菌體中間略飽滿,兩端呈 鈍圓形,周身有鞭毛,具運動性[1],廣泛存在于奶酪、天然酸奶、酒窖泥、土壤及人與動物糞便中[2]。丁酸梭菌代謝過程中主要產物為丁酸,在反芻動物腸道中,丁酸能夠被結腸上皮細胞代謝利用并產生能量。做為產芽孢菌,丁酸梭菌具有耐熱、耐酸、耐多種抗生素等能力[3],可調節動物腸道內的微生態平衡,具有調整腸道功能的作用。丁酸梭菌還具有抗癌、提高機體免疫力、抗氧化等作用,目前已被制成微生態制劑廣泛地用于保健食品[4]。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      2009年丁酸梭菌被農業部批準,允許作為活菌制劑在飼料中添加。微生態制劑能否作為活菌制劑被應用,取決于菌種的益生性能,以及其在后續加工過程中的抗逆性,能夠保證微生態制劑有效活菌數及產品的穩定性。丁酸梭菌作為一種梭狀芽孢桿菌,具有一定耐高溫、耐動物胃腸道環境的能力,但是這些特性在不同菌株之間存在較大的差異。所以,研究丁酸梭菌的益生性能及抗逆性顯得尤為重要,本研究中,以實驗室篩選得到的一株丁酸梭菌C-101為實驗菌株,研究了其高溫耐受能力,抑菌能力,耐胃酸,耐膽鹽能力,為該菌株的應用提供了理論基礎。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1 實驗材料與方法8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.1菌株8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      丁酸梭菌C-101:由好實沃生物保藏提供。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      指示菌:大腸埃希氏菌(Escherichiacol),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),單核細胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes,腸炎沙門氏菌(S. enteritidis)。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.2實驗材料8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      強化梭菌培養基(reinforced clostridial medium,RCM)、LB瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)培養基。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      種子培養基:RCM液體培養基。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      丁酸梭菌發酵培養基:蛋白胨 10.0 g,牛肉粉 10.0 g,酵母粉3.0 g,葡萄糖5.0 g,可溶性淀粉1.0 g,L-半胱氨酸鹽粉 3.0 g,磷酸氫二鉀 0.05 g,硫酸鎂0.08 g,硫酸錳0.002 g,純化水1000 mL,pH 7.0[5]。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      以上培養基制備完成后均需高壓滅菌備用,滅菌溫度121℃,滅菌時20min。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      人工胃液,人工腸液的配制參照《中國藥典》。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.3 實驗方法8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.3.1抑菌能力實驗8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      菌種準備:將甘油管保藏的丁酸梭菌C-101 0.1 mL接種到10 mL液體RCM培養基中,厭氧培養18 h,備用。將活化好的菌株接種于種子培養基,厭氧培養24 h,再按5%接種量,接種于發酵培養基,37℃厭氧培養48h后備用。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      將大腸桿菌、沙門氏菌劃線接種于LB固體培養基上37 ℃培養24 h, 依次用無菌生理鹽水洗脫菌體,制備菌懸液,并將菌懸液的菌濃度稀釋為106CFU/mL,備用。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      將金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌接種于TSA固體培養基上,于37 ℃條件下培養24 h,依次用生理鹽水洗脫,制備菌濃度為106CFU/mL左右的菌懸液后,備用。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      指示菌平板的制備:采用雙層平板法制備指示菌平板。取15 mL培養基加入到培養皿,凝固后作為下層;取5 mL含2%不同指示菌菌懸液的培養基加入凝固后的下層培養基上作為上層,待用。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      采用牛津杯法測定抑菌活性。在牛津杯中加入200 μL丁酸梭菌發酵上清液,于37 ℃條件下 培養16~18 h,觀察并測量抑菌圈直徑。每組測定兩個重復。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.3.2 菌懸液的制備8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      將活化好的菌株C-101種至種子培養基中,37 ℃厭氧培養24 h后,按5%接種量接種至發酵培養基,37 ℃厭氧培養48 h,發酵培養結束后,3 000 r/min離心10 min,收集菌體,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌兩次后重懸,使菌體濃度為4.5×108CFU/mL,備用。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.3.3耐熱性試驗8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      取上述菌液樣品1 mL到含9 mL甘油溶液(80%甘油)的試管中,充分混勻,分別置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、 90 ℃、100 ℃的水浴中處理5 min,置于0 ℃冰水混合物中冷卻,3000 r/min離心10 min,收集菌體,PBS洗滌兩次后重懸,采用梯度稀釋平板法測定其活菌數,每個樣品重復3次,計算存活率,其計算公式如下:8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      存活率=處理后活菌數/處理前活菌數×100%8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.3.4人工胃液耐受性試驗8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工胃液中,人工胃液最終pH值調為1.5左右,振蕩混勻,37 ℃水浴,每隔0.5 h取樣,將經過人工胃液處理后的菌懸液,3000 r/min離心10 min,PBS洗滌兩次后重懸,梯度稀釋法進行計數,每個樣品3個平行,計算存活率。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.3.5人工腸液耐受性試驗8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工腸液中振蕩混勻, 37 ℃水浴2.5 h,毎隔0.5 h取樣,3 000 r/min離心10 min, PBS緩沖液洗滌兩次后重懸,采用梯度稀釋法進行活菌計數,每個樣品3個平行,計算存活率。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      1.3.6膽鹽耐受性試驗8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      在RCM液體培養基中加入不同濃度的豬膽鹽,使其濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%,混勻,121 ℃、 15 min滅菌后備用。按107 CFU/mL接種量分別接種丁酸梭菌C-101.厭氧培養24 h,檢測活菌數,每個樣品重復3次。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      2. 實驗結果與討論8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      2.1 抑菌實驗8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      丁酸梭菌代謝產生的有機酸能夠降低腸道pH,同時產生細菌素,抑制腸道中致病菌的生長,丁酸梭菌對常見致病菌抑制能力結果如表1所示,結果顯示,丁酸梭菌C-101對常見致病菌具有顯著抑制能力,由于其產生的抑菌物質非單一有機物,所以,其抑菌物質仍待進一步的研究。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      表1 C-101對常見致病菌抑菌效果8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

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      2.2 耐熱性實驗8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      由表2可知,丁酸梭菌C-101具有良好的耐熱性,80攝氏度處理5min后,存活率仍可達99.5%,溫度繼續升高,存活率下降,對于飼料加工過程,需縮短熱處理時間。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      表2 C-101耐熱性能8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

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      2.3人工胃液耐受性8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      表3 C-101人工胃酸耐受性8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

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      動物胃液為酸性,pH一般在2.5-3.0[6],微生態制劑能否達到腸道發揮效應,需經過胃液,并保持一定的活性,由表3可知,丁酸梭菌經人工胃液處理后2.5h后活菌數仍能夠保持較高水平,活性降低13.3%,性狀優良,可以作為微生態制劑生產用菌種。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      2.4人工腸液耐受性8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      表4 C-101人工腸液耐受性8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

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      由表4可知,丁酸梭菌C-101對人工腸液具有很好的耐受性,人工腸液處理2.5 h,活菌數均為 4.45×108 CFU/mL,存活率98.9%,說明該菌株在腸道內保持較高的存活率。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      2.5 膽鹽耐受性8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

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    圖1 C-101膽鹽耐受性8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      動物腸道內膽鹽的質量分數約為0.03%-0.30%,菌株能否在腸道中定植,取決于菌株對膽鹽的耐受能力[7]。由圖1可知,菌株C-101對膽鹽具有很好的耐受性,在人工膽鹽濃度0.4%條件下能夠正常生長,當膽鹽濃度達到0.5%時受到抑制,可以保證其順利地通過小腸,并最終成功定殖于動物腸道后端。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      3. 結論8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      本研究以實驗室分離保藏的一株丁酸梭菌C-101為實驗菌株,對其抑菌能力,耐熱性,人工胃液,人工腸液,人工膽鹽耐受性,實驗結果顯示,該菌株對常見致病菌由顯著的抑制效果,耐熱性良好,能夠耐受飼料制?;蚣庸み^程的熱處理過程,對胃酸,腸液,膽鹽耐受性能優良,具有良好的應用潛力。8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      參考文獻8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      [1] 趙建新,張灝,田豐偉. 丁酸菌的分離、鑒定及篩選[J]. 食品與生物 技術學報,2002(6):597-601.612.8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      [2] 桂國弘,徐娥,楊華,等.丁酸梭菌調節腸道健康的作用機制 [J]. 飼料研究,2016( 22) : 42-46.8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      [3] 田召芳,李春蕾,黨安坤. 丁酸梭菌作用機理與研究進展[J]. 中國畜禽種業,2017( 8) : 36-38.8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      [4] 熊祖明,袁杰利. 酪酸梭菌的研究與應用進展[J]. 中國微生態學雜志,2011.23( 12) : 1143-1145.8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      [5] 謝麗靜,王麗,王偉華等,丁酸梭菌優良菌株LXYB-2抑菌活性及抗逆性研究[J],中國釀造,2018.37(6):91-968Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      [6] 陳桂芳,劉艷,單春喬,等. 費氏丙酸桿菌生物學特性及與5株益生菌拮抗性試驗研究[J]. 中國釀造,2018.37(1):69-73.8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      [7] 張媛媛. 復合芽孢桿菌制劑發酵工藝及其耐受性研究[D]. 哈爾濱:東北林業大學,2012.8Wd中國飼料行業信息網-立足飼料,服務畜牧

      
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